細胞外囊泡（EVs）是細胞衍生出的膜結構囊泡，如外泌體、微囊泡和凋亡小體等。由于在囊泡腔內包裹著或在顆粒表面修飾著豐富的成分，EVs在治療各類危及生命的疾病方面有巨大潛力。通常情況下，源于免疫細胞外泌體對腫瘤表現出不同的免疫治療效果。另外，由于其天然*的特性，EVs在藥物遞送方面表現出zhuoyue的性能，包括但不限于固有穩定性、生物膜透性、低免疫原性和歸巢能力。前人研究證明，裝載阿霉素的外泌體對乳腺癌細胞有靶向細胞毒性作用，且與游離藥物相比，心臟毒性和副作用更小。另外一個研究表明，裝載紫杉醇的外泌體對多藥耐藥肺癌有良好的治療效果。外泌體甚至能夠通過血腦屏障遞送藥物，為神經系統疾病提供了可能的解決方案。除了有效的體內外實驗結果外，將外泌體作為藥物載體有著巨大的轉化潛力。源于間充質干細胞的外泌體裝載KRAS G12D siRNA后對胰腺癌的治療效果正進行Ⅰ期研究。盡管前景廣闊，但它們距離全面臨床轉化階段還很遠。一個最重要的原因就是大多數EVs由于其納米直徑被保留在網狀內皮系統中，然后被單核巨噬細胞和其他細胞吸收。為了提高藥物遞送精度和減少副作用，在目標組織處通過EVs釋放特定藥物非常可取，但具有挑戰性。

在過去的幾十年里，光動力療法（PDT）由于其突出的優勢，已成為癌癥治療的新模式，比如時空可控性、最小侵入性、高效性和低毒性。該療法已被證實對多種有效，且目前幾種光敏劑已被美國食品和藥物管理局批準用于治療某些癌癥。此外，該療法與其他治療方法結合，可進一步提高治療效果（比如光熱療法、放射療法、免疫療法和基因療法）。PDT與PDL-1檢查點阻斷免疫療法的協同作用，不僅可以消除原發性腫瘤，而且可以觸發系統性的腫瘤特異性細胞毒性T細胞反應，從而*抑制未治療的轉移瘤。即便如此，PDT對深部腫瘤的治療效果受到激發光透性差、效率低的嚴重影響。作為一個有吸引力的替代方案，光敏劑通過原位化學反應產生化學能的激發不受透性的限制。Yu等通過構建基于化學發光共振能量轉移的仿生納米反應器，制定的光動力-饑餓協同治療策略對深部轉移瘤表現出良好的治療效果。然而，由于化學能通常是H₂O₂與過氧草酸酯衍生物反應產生的，此類化學激發PDT嚴重依賴于過氧化氫。盡管與正常組織相比，腫瘤微環境中的H₂O₂水平升高，但持續的反應會迅速耗盡腫瘤組織局部的H₂O₂供應，PDT的治療效果將明顯受限。為了提高化學激發的PDT效率，需要在腫瘤微環境中充分補充H₂O₂。然而，H₂O₂增強劑的可靠性以及增強劑與光敏劑(PSs)共同遞送到腫瘤的有效策略仍然十分有限。

該研究構建了自激活自發光的EVs遞送系統，同時展示三種協同抗癌治療模式。源于M1巨噬細胞的EVs（M1 EVs）和雙[2,4,5-三氯-6-（戊氧羰基）苯基]草酸酯（CPPO），二氫卟酚e6（Ce6）共同孵育后，用多柔比星原藥aldoxorubicin（Dox-EMCH）進行電轉化，以獲得裝載CPPO、Ce6和Dox-EMCH的EVs（M1CCD）。系統給藥后，由于M1 EVs天然的靶向能力，制備的M1CCD在腫瘤中不斷積累，而M1 EVs有效地將促腫瘤的M2巨噬細胞重新誘導為抗腫瘤的M1巨噬細胞，不僅表現出免疫治療活性，而且產生H₂O₂。CPPO與增多的H₂O₂反應，產生的化學能在沒有光激發的情況下直接激活光敏劑Ce6，產生用于成像的化學發光和用于PDT的單線態氧（¹O₂）。與此同時，由¹O₂引起的膜破裂導致前藥Dox-EMCH釋放，隨后在酸性微環境中被迅速激活轉化為毒性阿霉素（Dox），并滲透到腫瘤深部的低氧組織。免疫療法，光動力療法和化學療法的協同作用產生了強大的抗癌效果和較小的副作用。這種智能工程化的EV遞送系統作為癌癥治療候選方案非常有前景。

基本信息

摘 要

細胞外囊泡（EVs）在疾病治療和藥物遞送方面都具有巨大潛力。然而，準確地從細胞外囊泡釋放藥物，以及細胞外囊泡和藥物在目標組織處的自發治療效果協同作用仍然具有挑戰性。本研究報道了一種工程化的自激活光-EV，用于協同三模式抗癌治療。M1巨噬細胞衍生的細胞外囊泡（M1 EVs）同時裝載CPPO，Ce6和Dox-EMCH。給藥后，由于M1 EVs的腫瘤歸巢能力，制備的該系統可主動靶向腫瘤，其中M1 EVs將M2重新極化為M1巨噬細胞，不僅顯示出免疫療法的作用，而且進一步提高腫瘤微環境中的H₂O₂。H₂O₂和CPPO之間發生反應，產生化學能，激活Ce6，產生用于成像的化學發光和用于PDT的¹O₂。同時，由¹O₂引起的膜破裂導致Dox-EMCH釋放，被釋放的Dox-EMCH隨后被特異性激活并滲透到腫瘤的低氧組織。免疫療法，光動力療法和化學療法的協同作用可產生有效的抗癌功效，顯示出抗擊癌癥的巨大希望。

研究內容及結果

1. M1CCD具有自激活化學發光和¹O₂生成能力

小鼠原始腹腔巨噬細胞首先用1ug/mL脂多糖（LPS）處理24小時極化形成M1巨噬細胞，通過流式細胞術確定極化效果。隨后用經驗證的超速離心程序純化M1 EVs。EVs的磷脂雙分子層通過疏水作用將CPPO和Ce6包裹起來，形成的親水管腔裝載水溶性的Dox-EMCH。為了裝載盡可能多的藥物，首先，作者分別研究了M1 EVs（約10¹⁰細胞顆粒mL^-1）中CPPO、Ce6和Dox-EMCH的裝載能力，發現裝載飽和濃度分別為100、160和250 ug/mL。然后將相同數目的M1 EVs（約10¹⁰細胞顆粒mL^-1）用100 ug/mL的CPPO和160 ug/mL的Ce6孵育，用250 ug/mL的Dox-EMCH進行電轉化。通過CPPO、Ce6和Dox-EMCH紫外吸收光譜的特征吸收峰及其標志物的熒光成像效果驗證這些藥物是否成功裝載（圖2a,b）。每1×10¹⁰M1 EVs顆粒（n=6）CPPO、Ce6和Dox-EMCH的裝載量分別為16.7±0.8,5.4±0.3,12.7±0.5ug。與原始M1 EVs相似，M1CCD的形態為典型的杯狀（圖2c），且裝載藥物后其Zeta電位幾乎不變。M1CCD的水動力學尺寸為165±31nm（n=6），與原始M1 EVs相比增加了約36nm。M1CCD可在鹽酸鹽緩沖液（PBS）或10%胎牛血清中保存一周，顯示出良好的穩定性（圖2d，e）。

為實現化學激發的光動力療法，有必要確定光敏劑的分子最高占據軌道（HOMO）與化學激發源的分子低占據軌道（LUMO）間的電子轉移。對M1CCD來說，Ce6為光敏劑，CPPO與H₂O₂反應的中間產物1,2-二氧雜環丁烷二酮為化學激發源。通過Gaussian 09計算，Ce6的分子最高占據軌道能和1,2-二氧雜環丁烷二酮的分子低占據軌道能分別為-5.23和-3.20eV。這個2.03eV的能量差足夠CPPO直接激發Ce6，反應產生化學熒光（圖2f）。在H₂O₂存在的情況下，不同形式M1 EV化學熒光圖像表明M1 EVs、裝載CPPO的M1 EVs（M1@CPPO）和裝載Ce6的M1 EVs幾乎都沒有這種熒光信號。然而，M1CCD和同時裝載CPPO、Ce6的M1 EVs（M1CC）可以產生特定化學熒光，這證實Ce6只有在CPPO和H₂O₂的作用下才可以被激發。在M1CCD一定的情況下，化學熒光強度與H₂O₂濃度呈現出良好的線性關系。因此，這能夠用于追蹤小鼠腹膜炎不同發展階段的情況。同時，受激發的Ce6通過系統間交叉（ISC）將一些電子轉移給分子氧，產生用于PDT的化學熒光產物¹O₂。

2. M1CCD能有效地將M2巨噬細胞重新極化為M1表型

巨噬細胞一般分為2種類型：抗腫瘤M1細胞和促腫瘤M2細胞，而大多數腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）屬于免疫抑制型M2巨噬細胞。幸而，M1 EVs能夠不斷將M2巨噬細胞轉化成M1巨噬細胞，不僅可以吞噬腫瘤細胞，而且可以有效地產生包括H₂O₂在內的活性氧（ROS），以便于CPPO順利激活Ce6。為了確定M1CCD的重極化能力，將PBS（空白對照）、來自巨噬細胞的原始EVs（M0 EVs，陰性對照）、M1 EVs、M1CCD和LPS（陽性對照）分別與M2巨噬細胞孵育24小時。正如預期的是，經M1 EVs處理的細胞中M1協同刺激因子CD86（圖3a）和抗腫瘤炎癥因子IL-6、TNF-α（圖3b）的表達顯著提高，而M2巨噬細胞典型標志物CD206的表達降低，這表明M2巨噬細胞成功轉化為M1巨噬細胞。值得注意的是M1CCD的重極化能力與M1 EVs和LPS相當。結果顯示，M1 EVs、M1CCD和LPS處理組的H₂O₂濃度顯著增加，M1CCD處理組的H₂O₂濃度相對較低可能是由于被CPPO迅速消耗（圖3c）。近期，細胞形態的變化被視為巨噬細胞極化的可靠特征。作者也發現M2巨噬細胞形態較長，但是經M1CCD處理后細胞呈餅狀。為了進一步研究M1CCD是否能夠提高重極化巨噬細胞的吞噬能力，將經過不同處理的用CFSE標記的4T1腫瘤細胞與M2巨噬細胞共同孵育。隨后，巨噬細胞用PE標記抗小鼠CD11b抗體染色，用激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）成像。如圖3d所示，經PBS和M0 EVs處理的M2巨噬細胞無法吞噬4T1腫瘤細胞，與之相反的是，經M1CCD、M1 EVs和LPS處理的M2巨噬細胞幾乎吞噬了全部的4T1腫瘤細胞。結果顯示，M1CCD處理組中85.3%的巨噬細胞PE染色和CFSE染色均呈陽性。總之，以上結果證明，M1CCD能夠有效地重編程M2巨噬細胞，產生H₂O₂，為光動力療法和免疫療法提供可行性。

 3.在M1 EVs中，CPPO和Ce6執行有效的PDT作用，并促進Dox-EMCH的釋放

在這個化學激活的光動力療法系統中，CPPO與H₂O₂反應產生高能中間產物-1,2-二氧雜環丁烷二酮，然后激活Ce6，將電子轉移給分子氧，產生¹O₂。對應的，¹O₂的產生與H₂O₂的濃度緊密相關。與正常細胞相比，腫瘤細胞通常產生更多的H₂O₂。為了估計腫瘤細胞相對正常細胞化學激活的¹O₂的產出，用PBS、M1@CPPO、M1@Ce6和M1CC分別處理4T1細胞和J774A.1細胞，用2',7'-二氯二氫熒光素（DCFH-DA）檢測¹O₂的生成量。同預期一樣，所有J774A.1細胞處理組均出現輕微的¹O₂熒光信號，經PBS、M1@CPPO和M1@Ce6處理的4T1細胞也出現輕微的熒光信號，但M1CC處理組顯示出更亮的熒光信號，強度是PBS對照組的20倍。上述結果表明，由于激活狀態Ce6的存在，¹O₂在H₂O₂充足的腫瘤細胞中可以特定地產出。因此，M1CC對正常細胞影響很小，而對4T1細胞有明顯的細胞毒性，且呈劑量依賴性。而且，添加H₂O₂能夠進一步增強細胞毒性。具體來說，經每毫升6.4×10⁹顆粒的M1CC處理后，4T1細胞活力為43%，而添加100×10^-6M H₂O₂后，細胞活力降到14%（圖4a）。考慮到腫瘤微環境中存在許多M2巨噬細胞，且M1 EVs能夠將M2巨噬細胞重極化為M1巨噬細胞，而使H₂O₂濃度明顯增加，作者用一個體外Transwell模型進一步研究了M1CC誘導的4T1細胞凋亡。在該模型中，M2巨噬細胞在腔體頂部孵育，4T1細胞在腔體底部（圖4b）。然后，將PBS、裝載CPPO和Ce6的M0 EVs（M0CC）、M1CC分別加到模型的頂部和底部，孵育48小時以使頂部的M2巨噬細胞重極化為M1巨噬細胞，誘導底部PDT的化學激活。最后，用流式細胞術分析4T1細胞活力發現，M0CC處理后4T1細胞的凋亡總量為57.9%，M1CC處理組細胞凋亡量達76%，這表明，M1CC在特定的腫瘤微環境中能夠展現出對PDT有效的影響。

M1 EVs可以提高腫瘤微環境中的H₂O₂含量，進而增強化學激活PDT的效果。但這毫無疑問會受到腫瘤深處缺氧狀態和納米EVs低滲透性的限制。鑒于小分子藥物具有強滲透性這一可行性，因此將化學療法納入到系統中進一步提高療效。Dox-EMCH是源自阿霉素的腙類物質，分子中對酸敏感的腙連接體在微酸環境能夠釋放阿霉素。因此，在體外（包括人類）腫瘤微環境的pH6.5下，它展現出強烈的細胞毒性，但在pH7.4時對細胞影響較小。多細胞球（MCSs）模型結果明確表明，游離Dox-EMCH能夠滲透到腫瘤組織深處。相反的是，與其他小分子相比，裝載到M1 EVs中的Dox-EMCH（M1D）由于EVs巨大的體積使其滲透能力大大降低。有趣的是，與M1D相比，裝載到M1CCD中的Dox-EMCH的滲透深度顯著恢復，這可能是因為M1CCD能夠在MCSs中有效地產生¹O₂，誘導M1 EVs胞膜破裂，釋放Dox-EMCH（圖4d）。

4. M1CCD主動靶向腫瘤組織并顯示出有效的治療功效

將4T1腫瘤模型小鼠分為9組，分別用不同制劑治療，包括PBS、M1 EVs、Dox、M0CC、M0D、M1CC、M1D、M0CCD和M1CCD（圖5a）。如圖5b所示，M1 EVs和Dox輕微抑制腫瘤的生長，小鼠最終在21天內死亡。與M1 EVs、M0CC和M0D相比，由于免疫療法與光動力療法或者免疫療法與化學療法的協同作用，M1CC、M1D和M0CCD明顯抑制了腫瘤的發育。值得注意的是，M1CCD處理組的腫瘤幾乎被*抑制，40天觀察期內的存活率為100%（圖5c）。不同處理組腫瘤平均重量也證明M1CCD的抗腫瘤效果好（圖5d）。M1CCD的腫瘤抑制率（以腫瘤體積計算）為91.6%，遠高于M1 EVs（17%）、M1CC（61%）和M1D（70%）（圖5e）。另外，H&E和Ki67染色結果表明，M1CCD處理組促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增生的能力*（圖5f）。

結 論

作者通過將CPPO、Ce6和Dox-EMCH裝載到M1 EVs中，構建自激活的光-胞外囊泡，用于協同三模態抗癌治療。給藥后，獲得的M1CCD能夠通過M1 EVs天然的腫瘤歸巢能力主動靶向腫瘤。因此，免疫療法，光動力療法和化學療法以自激活和相互協同的方式，通過M1CCD與特殊的腫瘤微環境的相互作用，產生強大的抗癌效果和較小的副作用。未來研究團隊將繼續開發抗癌效果更好的治療策略，比如增強M1 EVs的特定靶向能力，開發化學發光效率和PDT效應更強的新型光敏劑。

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