1.眼部新生血管疾病中VEGF上調(diào)與炎癥的關(guān)系

研究人員通過觀察外周血中VEGF和炎性細(xì)胞因子的上調(diào)，開始認(rèn)識(shí)到血管生成和炎癥在眼部新生血管疾病中的潛在雙重功能。CNV和RNV患者房水中VEGF和炎性細(xì)胞因子的上調(diào)，然而，它們之間的關(guān)系主要在小型人群中中得到正式檢查。因此，作者從大量患者中收集房水樣本CNV（n=53；補(bǔ)充表1），RNV（n=52；補(bǔ)充表2）和對(duì)照受試者（n=50；補(bǔ)充表3），并使用CBA檢測技術(shù)來量化VEGF和其他促炎細(xì)胞因子（圖1a和補(bǔ)充圖1a）。如圖1b所示，CNV患者的VEGF表達(dá)比健康對(duì)照組高3倍。CNV患者的主要促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子（TNF），均分別上調(diào)3倍，10倍和3倍（圖1b）。如報(bào)告所述，IL-6炎性細(xì)胞因子可誘導(dǎo)VEGF的產(chǎn)生。此外，作者觀察到促炎性細(xì)胞因子水平與VEGF之間存在強(qiáng)正相關(guān)（圖1c和補(bǔ)充圖2a）；平均黃斑厚度（MMT）與VEGF和促炎細(xì)胞因子IL-6和IL-1β相關(guān)（圖1c和補(bǔ)充圖2a）。RNV患者表現(xiàn)出類似的促炎細(xì)胞因子上調(diào)，并與MMT相關(guān)（補(bǔ)充圖。1b、c和2b）。這些結(jié)果不僅證實(shí)了先前關(guān)于VEGF和促炎細(xì)胞因子在眼部新生血管疾病中異常上調(diào)的報(bào)道，而且還揭示了VEGF介導(dǎo)的眼部新生血管與炎癥之間的關(guān)聯(lián)，其中IL-6和IL-1β可能在這些疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。為了研究眼部新生血管的組織病理學(xué)，作者使用了臨床前小鼠和非人靈長類CNV模型，該模型由眼底激光光凝誘導(dǎo)（圖1d和補(bǔ)充圖3）。

作者檢測到CNV誘導(dǎo)的小鼠房水中VEGF（約3倍）和促炎細(xì)胞因子IL-6（20倍）、IL-1β（3.5倍）和TNF（3.5倍）顯著增加（圖1e），食蟹猴模型中也有類似的失調(diào)（補(bǔ)充圖4）。此外，作者分析了CNV誘導(dǎo)的小鼠脈絡(luò)膜組織中的新生血管病變。激光光凝誘導(dǎo)新生血管形成，內(nèi)皮素（CD105）表達(dá)，但在對(duì)照組小鼠中很少有相關(guān)變化（圖1f）。CD105⁺血管有大量的VEGF生成并富集，被大量F4/80⁺巨噬細(xì)胞包圍，這表明VEGF上調(diào)和浸潤的免疫細(xì)胞在促進(jìn)眼部新生血管形成中的協(xié)調(diào)作用。此外，作者在CNV新生血管病變周圍檢測到MMP2和MMP9的大量表達(dá)；在對(duì)照組的小鼠中未觀察到相應(yīng)變化（圖1g）。這種MMP的高表達(dá)，可能是由浸潤的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，MMP將重塑細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤和血管生成。從CNV患者和臨床前動(dòng)物模型的結(jié)果表明，VEGF和炎癥之間的協(xié)同作用促進(jìn)了眼部新生血管疾病。

2.可切割的aV與工程化rREX的耦合連接

研究結(jié)果表明，針對(duì)眼部血管疾病采用靶向VEGF和炎癥的的聯(lián)合治療策略更加可行。CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg細(xì)胞是維持免疫耐受和控制炎癥的主要的潛在機(jī)制。眼內(nèi)細(xì)胞，特別是色素上皮細(xì)胞，具有調(diào)節(jié)特性，可誘導(dǎo)眼內(nèi)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，防止炎癥和維持眼免疫赦免。但由于玻璃體腔內(nèi)注射Treg細(xì)胞并通過炎癥介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化為其他T細(xì)胞類型，對(duì)視力有不良影響，因此這種方法不適用于眼血管疾病的治療。Treg衍生的外泌體是一類由Treg細(xì)胞內(nèi)源性分泌的脂質(zhì)雙層囊泡（直徑為30–150nm），具有良好的生物相容性、低細(xì)胞毒性、免疫惰性和特異靶向性。Treg衍生的外泌體表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，有可能作為成品用于急性環(huán)境，而細(xì)胞需要很長時(shí)間才能分離和生長。為了產(chǎn)生REX，在標(biāo)準(zhǔn)分化條件下，將原始CD4⁺T細(xì)胞極化以誘導(dǎo)Treg細(xì)胞7天（補(bǔ)充圖5），并使用超速離心法從培養(yǎng)上清中分離外泌體。

作者設(shè)計(jì)了一種雙靶向策略，將aV與cL（Arg-Val-Gly-Leu-Pro）結(jié)合到rEXS上，cL可被MMPs切割（補(bǔ)充圖6）。通過將N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和6-馬來酰亞胺引入連接體的兩端來實(shí)現(xiàn)共軛，連接體分別與aV中的氨基和rEXS上的巰基反應(yīng)。結(jié)果表明，納米藥物rEXS–cL–aV有望通過aV阻斷VEGF活性和rEXS減輕炎癥，從而最大限度地發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。結(jié)果表明，rEXS上的趨化因子受體可通過炎性趨化因子的梯度增強(qiáng)該納米藥物在新生血管病變中的積累，一旦納米藥物接近新生血管病變，MMP的存在可切割連接物并釋放aV以達(dá)到局部高濃度（圖2a）。

透射電子顯微鏡（TEM）顯示rEXS-cL-aV典型的杯狀外泌體形態(tài)，平均直徑約為120nm（圖2b）。通過二級(jí)免疫抗體金納米顆粒的結(jié)合驗(yàn)證了aV在rEXS表面的成功偶聯(lián)（圖2c），偶聯(lián)密度可達(dá)每rEXS約10個(gè)aV分子。進(jìn)一步支持成功修飾的是，aV信號(hào)在共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）和插入的受激發(fā)射耗盡（STED）圖像中與rEXS信號(hào)高度共域（圖2d），rEXS-cl-aV的尺寸略有增大，ζ電位略有降低（與rEXS相比）（圖2e）。免疫印跡進(jìn)一步驗(yàn)證了rEXS-cL-aV上存在外泌體標(biāo)記物（CD9、CD47、ALIX和TSG101）、趨化因子受體（CCR6）、Treg免疫抑制蛋白（IL-10和CTLA-4）和偶聯(lián)aV（圖2f和Supplementary Fig 7）。這幾乎被MMP9抑制劑GM6001*抑制（圖2g）。被釋放的aV也顯示了類似與VEGF的結(jié)合能力，表明aV的偶聯(lián)和釋放循環(huán)并不影響其中和能力（圖2h）。最后，rEXS-cL-aV顯示出了可靠的穩(wěn)定性，在4°C磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中儲(chǔ)存（圖2i和補(bǔ)充圖8）或凍干和復(fù)溶（圖2j）后，沒有檢測到粒徑和ζ電位的變化。這些結(jié)果驗(yàn)證了工程化rEXS-cL-aV具有理想穩(wěn)定性特征可用于疾病的治療。

3.rEXS-cL-aV在體外對(duì)CECs遷移和存活的雙重抑制以及對(duì)巨噬細(xì)胞的促炎分化作用

作者建立了一個(gè)Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)來測試rEXS–cL–aV在抑制CNV相關(guān)血管生成和炎癥中的作用。將原代脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞（CEC）培養(yǎng)在頂腔中以模擬血管生成，并將經(jīng)脂多糖（LPS）預(yù)處理以極化為促炎1型巨噬細(xì)胞（M1）的原代巨噬細(xì)胞接種在下腔中以模擬炎癥微環(huán)境。對(duì)CEC遷移的評(píng)估表明，與PBS或nEXS相比，rEXS、aV或rEXS–fL–aV處理的CEC遷移減少，而rEXS–cL–aV處理的CEC遷移受到強(qiáng)烈抑制（圖3b和補(bǔ)充圖9）。值得注意的是，rEXS–cL–aV在誘導(dǎo)CEC死亡方面更有效，其效率分別比rEXS–fL–aV、aV和rEXS高出約2倍、3倍和6倍（圖3c）。CLSM分析顯示所有類型的外泌體都被巨噬細(xì)胞吞噬。

rEXS–fL–aV治療導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)aV的消耗，如巨噬細(xì)胞內(nèi)aV和rEXS的共同染色所示；然而，在用rEXS–cL–aV治療的巨噬細(xì)胞中很少觀察到這種情況（圖3d和補(bǔ)充圖10）。這表明作者設(shè)計(jì)的可切割連接物可以減少巨噬細(xì)胞中aV的消耗，并提高其對(duì)CEC的生物利用度。此外，作者還檢測了培養(yǎng)上清液中VEGF和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。用aV（aV、rEXS–fL–aV或rEXS–cL–aV）治療可有效降低可溶性VEGF濃度，而用rEXS（rEXS、rEXS–fL–aV或rEXS–cL–aV）治療可有效降低IL-6、IL-1β和TNF的產(chǎn)生（圖3f）。總體而言，rEXS–cL–aV優(yōu)于rEXS–fL–aV，并且在抑制炎癥方面比其他治療方法表現(xiàn)出更高的效率。這一結(jié)果得到了其對(duì)巨噬細(xì)胞中CD86上調(diào)進(jìn)行抑制的支持（圖3e和補(bǔ)充圖11）。

4.在激光誘導(dǎo)的CNV小鼠模型中，眼內(nèi)滯留、CNV損傷靶向和rEXS–cL–aV的時(shí)空耦合釋放

作者在激光誘導(dǎo)的CNV小鼠模型中評(píng)估了其眼內(nèi)藥效學(xué)（圖4a）。CNV誘導(dǎo)后，玻璃體內(nèi)注射rEXS和aV（rEXS+aV）、rEXS–fL–aV或rEXS–cL–aV的混合物。使用活體成像進(jìn)行實(shí)時(shí)分析，量化aV（用Alexa Fluor 647標(biāo)記）或rEXS（用DiR標(biāo)記）在7d內(nèi)的滯留和眼內(nèi)分布。在用rEXS+aV治療的小鼠中，玻璃體腔中的熒光aV信號(hào)在24h內(nèi)減少一半以上，在96h內(nèi)幾乎消失，而rEXS–fL–aV和rEXS–cL–aV的熒光aV信號(hào)保留更長時(shí)間，注射后4d，信號(hào)超過50%或原始水平，注射后7d，信號(hào)約為25%（圖4b，c）。aV生物利用度的提高可歸因于外泌體的結(jié)合，這表明在玻璃體中消除緩慢。鑒于激光誘導(dǎo)的CNV病變主要位于黃斑部，作者檢測了rEXS熒光信號(hào)，并計(jì)算了所有治療中的前后比值。然而，三組房室熒光信號(hào)的前后比率不同。來自rEXS+aV治療的自由遞送的aV均勻分布，前后比為1，而來自rEXS–cL–aV和rEXS–fL–aV治療的aV顯示為3.5（圖4b，d），表明aV與rEXS的結(jié)合促進(jìn)了其在CNV病變中的積聚。rEXS–cL–aV和rEXS–fL–aV之間的aV信號(hào)強(qiáng)度具有平行性，從而支持了控制釋放的假設(shè)，并證明在運(yùn)輸?shù)紺NV病變后部的時(shí)間之前，rEXS–cL–aV的aV釋放可以忽略不計(jì)。通過分析整個(gè)眼球組織切片（補(bǔ)充圖12），也證實(shí)了aV信號(hào)在整個(gè)玻璃體室中的明顯擴(kuò)散模式。rEXS集中趨向于于CNV病變的能力可能歸因于炎癥病變中趨化因子（如CCL20）的上調(diào)以及來自親代Treg細(xì)胞的rEXS上趨化因子受體（如CCR6）的表達(dá)。

基于上述結(jié)果，作者使用四甲基異硫氰酸羅丹明-右旋糖酐作為血管內(nèi)對(duì)比劑和DiO標(biāo)記的rEXS，在體內(nèi)使用雙光子熒光顯微鏡檢測CNV病變中活躍新生血管的形成。成像結(jié)果顯示rEXS+aV、rEXS–fL–aV和rEXS–cL–aV中的rEXS能夠精確靶向CNV病變中形成的新血管（圖4e）。最后，作者使用CLSM成像分析了眼球組織切片，以檢查納米藥物積聚到CNV病變附近后，rEXS–cL–aV的aV切割情況。與rEXS–fL–aV處理的小鼠眼球組織中aV和rEXS信號(hào)的強(qiáng)烈重疊相反，rEXS–cL–aV樣本中的兩個(gè)信號(hào)之間存在重大偏差（圖4f），這可歸因于由于炎癥病變中MMP水平顯著增加，連接子的有效切割從rEXS–cL–aV釋放aV（補(bǔ)充圖13）。因此，rEXS–cL–aV表現(xiàn)出眼內(nèi)滯留、CNV病變靶向性和時(shí)空控制釋放，表明其潛在的后續(xù)治療效果。

5.rEXS–cL–aV納米藥物在激光誘導(dǎo)CNV小鼠模型中的療效和安全性

作者在激光誘導(dǎo)的CNV小鼠模型中測試了rEXS–cL–aV的治療效果，評(píng)估了所有對(duì)照組的納米藥物，包括單個(gè)部分和rEXS–fL–aV（圖5a）；對(duì)脈絡(luò)膜新生血管組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析；分析顯示了來自前50個(gè)KEGG途徑和基因簇的數(shù)據(jù)。KEGG途徑富集分析顯示，rEXS–cL–aV治療可調(diào)節(jié)與免疫調(diào)節(jié)（如細(xì)胞因子和趨化因子信號(hào)通路）和血管生成（如細(xì)胞粘附分子和粘著斑通路）相關(guān)通路中的基因表達(dá)。差異表達(dá)基因的分層聚類分析顯示，rEXS–fL–aV和rEXS–cL–aV顯著下調(diào)與炎癥相關(guān)的基因（例如，Ly6c2、Il2ra、Il1b、Ccl5和Trbc1）。rEXS–fL–aV和rEXS–cL–aV也下調(diào)了具有與血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)功能的基因（例如Adam7和Mmp8）（圖5b）。因此，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析支持通過rEXS–fL–aV和rEXS-cL–aV治療炎癥和血管生成的協(xié)同靶向性。此外，與rEXS–fL–aV相比，rEXS–cL–aV治療導(dǎo)致顯著的基因下調(diào)，強(qiáng)調(diào)了aV反應(yīng)性釋放在CNV病變中的重要性。因此，與PBS對(duì)照組相比，rEXS–cL–aV治療顯著降低了房水VEGF（6倍）、IL-6（12倍）、IL-1β（3倍）和TNF（4.5倍）的水平，并優(yōu)于所有其他對(duì)照組（圖5c）。

為了直接評(píng)估治療效果，作者使用眼底熒光血管造影（FFA）測量CNV病變中高熒光滲漏部位的數(shù)量和面積。使用rEXS或游離aV的單一療法不足以顯著減少高熒光滲漏。成像顯示，與其他組相比，使用rEXS–cL–aV治療的小鼠表現(xiàn)出高熒光泄漏量最少，平均泄漏數(shù)量減少到1.6。使用rEXS+aV或rEXS–fL–aV的聯(lián)合治療可導(dǎo)致高熒光泄漏部位減少（2-3倍），而rEXS–cL–aV可導(dǎo)致高熒光泄漏部位的顯著減少，可減少8倍（圖5d、g和補(bǔ)充圖14a）。蘇木精-伊紅（H&E）染色rEXS–cL–aV治療導(dǎo)致CNV病變厚度最小，表明CNV病變迅速消退（圖5e，H）。

作者設(shè)計(jì)的rEXS–cL–aV能夠在CNV病變附近以高濃度聚集，以減輕炎癥，并在炎癥環(huán)境中MMP催化裂解時(shí)特異性釋放aV，從而抑制新生血管生成。免疫熒光染色顯示F4/80⁺巨噬細(xì)胞和CD105⁺新生血管大量存在于未治療小鼠的CNV病變中（圖5f）。rEXS–cL–aV單藥治療顯著降低巨噬細(xì)胞水平；然而，這種治療對(duì)新生血管的影響微乎其微。相反，如巨噬細(xì)胞水平所示，單獨(dú)使用aV治療可抑制新生血管生成，但只能適度控制炎癥。rEXS和aV的三種組合（rEXS+aV、rEXS–fL–aV和rEXS–cL–aV）治療效果顯示，rEXS–cL–aV的治療效果最高。盡管其具有有效的抗血管生成活性，rEXS–cL–aV治療沒有改變眼壓，也沒有顯示改變視網(wǎng)膜形態(tài)的跡象（圖5i，j），支持局部組織的安全性。在系統(tǒng)水平上，rEXS–cL–aV治療不會(huì)導(dǎo)致心臟、肝臟、脾臟、肺或腎臟的血液生化標(biāo)記物或組織學(xué)特征發(fā)生任何可檢測的變化，進(jìn)一步支持玻璃體內(nèi)給藥的安全性。

6.rEXS–cL–aV在激光誘導(dǎo)的非人靈長類CNV模型中的治療效果

在誘導(dǎo)CNV（每只眼睛中有九個(gè)激光點(diǎn)）后，向食蟹猴玻璃體內(nèi)注射藥物，并在20d后評(píng)估療效。對(duì)脈絡(luò)膜、脈絡(luò)膜毛細(xì)血管、視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）和光感受器（PR）層進(jìn)行光學(xué)相干斷層成像血管造影（OCTA）圖像分割。成像顯示，與其他組相比，經(jīng)rEXS–cL–aV治療的食蟹猴色素上皮脫落較少，平均數(shù)量減少至1.25（圖6c，左圖和補(bǔ)充圖14b）。視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）和光感受器（PR）的en face-OCT 圖像顯示了激光損傷點(diǎn)的最小水平尺寸（新形成的血管直徑和水腫程度）（圖6c，中間）。橫截面圖顯示，與其他組相比，使用rEXS–cL–aV治療的猴子顯示出更高的CNV病變分辨率，導(dǎo)致最小的垂直尺寸（病變延伸至視網(wǎng)膜下間隙）（圖6c，右側(cè)）。CNV病變水平和垂直尺寸的定量分析證實(shí)rEXS–cL–aV在抑制新血管生長方面*（圖6d）。與CNV中的結(jié)果相似，在小鼠模型中，rEXS–cL–aV的高效性伴隨著VEGF和促炎細(xì)胞因子的顯著降低。相比之下，rEXS單一療法在減輕炎癥方面優(yōu)于aV單一療法，而aV單一療法在降低VEGF方面更有效（圖6e）。

在安全性評(píng)估期間，作者使用裂隙燈觀察角膜、前房或晶狀體和眼壓，觀察到在接受或不接受rEXS–cL–aV治療食蟹猴的眼睛各種指標(biāo)均相似（圖6f）。未經(jīng)治療和rEXS–cL–aV治療的猴子血液學(xué)參數(shù)也相似，并且沒有副作用的跡象（圖6g和補(bǔ)充圖17）。