2.檢測羥基自由基

•OH的產生首先通過檢測3'-(對氨基苯基)熒光素的熒光增強(APF)，3'-(對氨基苯基)可以選擇性地與•OH反應并變成高熒光。如圖S7所示，在808nm激光照射下，在CuTz-1@F127 PBS溶液中，H₂O₂存在下觀察到APF熒光明顯增強。接下來，觀察到CuTz-1@F127在激光照射下在H₂O₂存在的情況下有效降解RhB（圖2a）。而且，DCFH-DA被用于監測細胞內ROS，由于DCFH-DA可以被細胞內的酯酶水解成DCFH，然后非熒光DCFH可以被•OH氧化成綠色熒光的二氯熒光素(DCF)。圖S8表明CuTz-1@F127用808nm激光(0.6 W cm^?2)照射10分鐘，細胞內ROS的產生，綠色熒光表明在激光照射下進一步產生了•OH。

3.谷胱甘肽還原的體外研究

考慮到癌細胞中過量的谷胱甘肽會減弱PDT的有效性。該團隊繼續研究CuTz-1@F127是否能降低細胞內GSH。首先，在GSH存在下，CuTz-1@F127保持完整（圖S9）。然后，使用GSH檢測試劑盒測定保留在上清液中的GSH含量。如圖2b所示，雖然GSH分子尺寸大于CuTz-1的孔徑，但CuTz-1@F127在水溶液中與GSH混合后，CuTz-1@F127的BET表面積從184.5 m²g^-1下降到 132.7 m²g^-1。該小幅下降表明GSH分子與Cu^I位點結合并占據部分CuTz-1@F127的微孔。元素映射結果（圖2d和圖S11）確認硫元素均勻分布在基體中，進一步證明了CuTz-1@F127可以吸附GSH。此外，為了驗證GSH對•OH氧化能力的影響，在RhB的降解實驗中加入GSH，并引入TiO₂（光催化劑）進行比較，如圖2a所示，CuTz-1@F127和TiO₂在808nm和氙燈激光照射下對RhB顯示出優異的降解效率。然而，當添加GSH時，TiO₂的降解能力嚴重減弱，CuTz-1@F127仍然可以降解近70%的RhB。這個結果表明CuTz-1@F127能有效降低GSH并保持•OH的殺傷力。

4.氧氣產生的體外研究

值得注意的是，MOFs是O₂存儲的良好候選者。該團隊測試了CuTz-1@F127的O₂吸附能力。氧吸附-解吸等溫線（圖2e）顯示CuTz-1@F127可以吸附標準大氣壓和室溫下高達400µmol g^?1的O₂。浸入O₂后，得到CuTz-1-O₂@F127（圖1a）。為了證明CuTz-1-O₂@F127的O₂產生和釋放性能，我們測量了808nm激光照射下的O₂濃度。如圖2f所示，在低H₂O₂濃度下，CuTz-1@F127 PBS溶液中觀察到O₂濃度增加，表明在類芬頓反應過程中產生了O₂。由于在近紅外光輻射刺激下Cu^I向Cu^II轉化過程中會產生電子和空穴，可能導致CuTz-1-O₂@F127可以釋放癌細胞內吸附的O₂，進一步緩解細胞內缺氧。最終，產生和釋放的O₂都可以克服細胞內缺氧，這在PDT中起著輔助作用。

5.細胞研究：細胞攝取、生物相容性和光細胞毒性

進一步進行體外實驗研究CuTz-1-O₂@F127的抗腫瘤功效。首先，倒置熒光顯微鏡圖像顯示納米顆?？赡苁窃?小時內被4T1細胞（小鼠乳腺癌細胞）內吞（圖S12）。然后，L929細胞（小鼠成纖維細胞）、HeLa細胞和4T1細胞用MTT細胞活力實驗來檢測生物安全性。如圖3a所示，雖然CuTz-1-O₂@F127的濃度為高達200×10^?6 M，L929細胞的活力在孵育24小時后仍然接近100%，表明CuTz-1-O₂@F127對正常細胞具有高度生物相容性。當CuTz-1-O₂@F127的濃度超過100×10^?6 M時，HeLa和4T1癌細胞的活性降低。這是因為CuTz-1-O₂@F127可以吸附細胞內的GSH，并且GSH的減少影響癌細胞的正常生長，導致癌細胞和正常細胞活力的差異。接下來，CuTz-1@F127和CuTz-1-O₂@F127與4T1細胞一起孵育，在缺氧和常氧條件下，檢測PDT效果。CuTz-1@F127+光和CuTz-1-O₂@F127+光處理后，與4T1細胞孵育24小時，MTT法檢測細胞活力。如圖3b所示，缺氧處理組在光照下表現出比常氧細胞更高的細胞存活率。該結果表明細胞內缺氧促進癌細胞增殖，進一步說明了腫瘤治療過程中克服缺氧的重要性。正如預期的那樣，CuTz-1-O₂@F127+光處理組在缺氧條件下的治療效果與常氧條件下相似，并且治療效果隨著CuTz-1-O₂@F127濃度的增加而增加。流式細胞術分析（圖S13）進一步證明了CuTz-1-O₂@F127+光處理組顯示出低的腫瘤細胞存活百分比（約21.1%）。

6.ROS和缺氧的細胞內檢測

使用ROS-ID缺氧/氧化應激檢測試劑盒來研究細胞內ROS和缺氧。如圖3c所示，對照組在沒有光照的情況下沒有產生活性氧；然而，在缺氧和常氧條件下，808nm激光照射組均檢測到強ROS信號，表明I型PDT過程即使在缺氧條件下也能產生大量的•OH。此外，近紅外光照射后，CuTz-1@F127+光和CuTz-1-O₂@F127+光組在缺氧條件下處理的細胞顯示比未照射的紅色熒光弱，表明CuTz-1@F127在NIR照射下可以在細胞中產生O₂，CuTz-1-O₂@F127+光組顯示出比CuTz-1@F127+光組更弱的紅色熒光，表明CuTz-1-O₂@F127可以進一步釋放它攜帶的O₂以緩解癌細胞的缺氧。

7.活/死細胞染色分析

為了進一步檢查CuTz-1 MOF系統在缺氧條件下的細胞光毒性，通過Calcein-AM/PI雙染試劑盒區分活細胞（綠色熒光）和死細胞（紅色熒光）。如圖3d所示，作為對照組，所有未經處理或用PBS+光、CuTz-1@F127和CuTz-1-O₂@F127處理的細胞，細胞均顯示綠色熒光，表明細胞幾乎沒有損傷。在808nm激光照射下，CuTz-1@F127處理組觀察到細胞顯示很微弱的綠色熒光，表明大多數細胞死亡。用CuTz-1-O₂@F127+光處理組觀察到細胞顯示紅色熒光，表明細胞均死亡。這些結果進一步表明CuTz-1-O₂@F127在克服缺氧以增強癌細胞的PDT方面具有*的治療效果。

8.體內腫瘤抑制能力

隨著PDT效應在體外被廣泛研究和認可，進一步研究了CuTz-1-O₂@F127在4T1荷瘤小鼠上體內的治療效果。實驗設計了六組帶有4T1腫瘤的雌性Balb/c小鼠（n=5），分別通過尾靜脈注射方法對其進行治療。每只按照20mg/kg的劑量注射，對照組為PBS，實驗組為PBS+光、CuTz-1@F127、CuTz-1@F127+光、CuTz-1-O₂@F127和CuTz-1-O₂@F127+光。每2天測量體重和腫瘤大小。圖4a顯示各組小鼠的體重隨著時間的推移逐漸增加，表明這些操作對小鼠的副作用很小。圖4b顯示了隨著時間的推移對腫瘤的治療效果。與對照組相比，CuTz-1@F127和CuTz-1-O₂@F127治療組均表現出一定的抑瘤作用。這是因為CuTz-1@F127可以降低腫瘤中GSH的水平（圖4c），從而影響癌細胞的正常生長。CuTz-1@F127+光和CuTz-1-O₂@F127+光治療組的腫瘤被有效抑制。此外，由于更多的O₂補充，CuTz-1-O₂@F127+光組表現出好的腫瘤抑制效果。上述結果表明，載氧MOF治療系統在808nm激光照射下可實現有效腫瘤抑制。治療14d后，處死所有小鼠，切除腫瘤并稱重。圖4d和圖S14顯示，CuTz-1-O₂@F127+光組中的腫瘤生長明顯受到抑制，可增強PDT療效。對腫瘤組織進行原位蘇木精和伊紅(H&E)染色，如圖4e所示，在CuTz-1@F127+光和CuTz-1-O₂@F127+光組都可以觀察到明顯的腫瘤組織壞死，表明•OH的殺傷力。同時，CuTz-1-O₂@F127、CuTz-1@F127+光、CuTz-1-O₂@F127+光各處理組和對照組的肝、脾、肺、腎、心臟等主要器官的H&E染色圖像顯示沒有發現明顯的組織損傷（圖S15）。正如預期的那樣，表明CuTz-1-O₂@F127具有良好的生物安全性。

9.體內長期毒性、生物分布和代謝研究

CuTz-1-O₂@F127的長期毒性和體內生物分布是通過對Balb/c小鼠進行靜脈注射NPs實現的。如表S1所示，血清生化數據顯示治療組與對照組之間沒有主要參數差異，包括心功能的肌酸激酶（CK）；腎功能的血尿素(BUN)和血清肌酐(CRE)；肝功能的谷丙轉氨酶（ALT），天冬氨酸轉氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)。為了確定體內CuTz-1-O₂@F127 NPs的生物分布，在尾靜脈注射后定期收集所有小鼠的腫瘤和主要器官。銅濃度用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS)進行檢測。如圖5a所示，在靜脈注射后的前12小時內，注射的NPs主要被肝臟和脾臟吸收。因為EPR效應，大量NPs可在腫瘤部位蓄積，24h左右達到最大值。然后隨著時間的延長，被檢測器官中的NPs減少。進一步研究了小鼠中NPs的代謝情況，有趣的是，如圖S16和S17所示，SEM和PXRD數據顯示CuTz-1-O₂@F127在第五天開始分解。在第10天，CuTz-1-O₂@F127*失去了其形態和晶體結構。因此，進一步測量了注射CuTz-1-O₂@F127的小鼠在不同時間點收集的糞便和尿液中Cu含量。在早期，肝臟中積累的NPs主要通過膽汁排泄到糞便中，一周后，降解后的NPs可通過腎臟排出，形成尿液（圖5b）。第14天，NPs隨尿液排出達到最大值。此后，排出量逐漸減少，30d后，NPs通過糞便和尿液以90%的高比率排出。這個現象表明雖然CuTz-1在GSH水溶液中穩定，但由于其復雜的TME和可生物降解性，可以排出體外，這極大地證明了CuTz-1-O₂@F127的生物降解性。