膀胱癌（BCa）是男性第四常見惡性腫瘤，也是女性常見的惡性腫瘤，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高。在BCa患者中，約75%為非肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌（NMIBC）。這些患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（TURBT）后進(jìn)行膀胱內(nèi)化療或免疫治療。然而30-80%的NMIBC患者在初次手術(shù)治療后5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，產(chǎn)生巨大的醫(yī)療費(fèi)用。研究表明，不良復(fù)發(fā)的原因是TURBT不*，膀胱灌注效率低導(dǎo)致殘留腫瘤持續(xù)或再生。臨床上的膀胱內(nèi)滴注化療藥物，由于在尿液滯留和排泄過(guò)程中的周期性稀釋和沖洗，無(wú)法在殘留的腫瘤區(qū)域精確地維持持續(xù)有效的藥物濃度。盡管已經(jīng)開發(fā)了合并納米載體和藥物遞送系統(tǒng)以優(yōu)化給藥，但有限的療效和未滿足的安全性（如尿路梗阻和膀胱刺激的風(fēng)險(xiǎn)）限制了其臨床應(yīng)用。因此，為準(zhǔn)確和*地殺死殘留的腫瘤，迫切需要智能和安全的膀胱內(nèi)制劑，即使在復(fù)雜的靜脈內(nèi)環(huán)境中也能實(shí)現(xiàn)精確的藥物富集和長(zhǎng)期釋放。

臨床上，TURBT優(yōu)于膀胱內(nèi)灌注。TURBT手術(shù)床不同于正常的尿路上皮，是殘留腫瘤周圍的特殊環(huán)境。它提供一個(gè)現(xiàn)成的特異性靶向平臺(tái)，藥物可以定位并直接進(jìn)入殺死潛在的殘留腫瘤細(xì)胞。雖然靶向手術(shù)床能夠?qū)堄嗄[瘤起到充分的殺傷作用，但膀胱這種pH值和滲透壓不斷變化的復(fù)雜液體環(huán)境，長(zhǎng)期穩(wěn)定的靶向作用是其臨床應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)。由于失去了皮膚等表層屏障的保護(hù)，細(xì)菌感染更容易發(fā)生在手術(shù)或燒傷等傷口上。細(xì)菌感染對(duì)傷口的偏好可能為解決手術(shù)床定位問(wèn)題提供新的思路。細(xì)菌感染由與宿主細(xì)胞的黏附引起，宿主細(xì)胞上的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）包括纖連蛋白（FN）、膠原蛋白、層粘連蛋白等通過(guò)細(xì)菌表面上的一組特定ECM附著分子為細(xì)菌直接黏附提供天然和多分子成分。在外部屏障被破壞后，損傷可能會(huì)暴露更多的ECM成分，從而增加穩(wěn)定細(xì)菌黏附的機(jī)會(huì)（方案1a）?？ń槊纾˙CG）是一種活的、減毒的牛分枝桿菌菌株，它可以通過(guò)手術(shù)特異性粘附于破壞的尿路上皮而不在正常的尿路上皮表面附著，這啟發(fā)作者實(shí)現(xiàn)膀胱手術(shù)床的特異性靶向。有文獻(xiàn)表明BCG特異性附著是由兩種成分介導(dǎo)的：BCG表面FN附著蛋白的FN結(jié)合肽（FBP）和TURBT手術(shù)暴露在手術(shù)床上的FN。

多肽除了具有生物相容性外還具有結(jié)構(gòu)和生物活性，是一種理想的生物材料。對(duì)多肽自組裝特性的研究不僅揭示了從納米粒子、納米纖維到納米網(wǎng)絡(luò)的一系列形態(tài)，而且拓寬了其在生物體中的應(yīng)用。作者代表性研究表明一系列自組裝肽可以在實(shí)體瘤中原位特異而牢固地形成3D纖維網(wǎng)絡(luò)，具有高蓄積性和長(zhǎng)期滯留，用于歸巢治療藥物、抑制轉(zhuǎn)移等。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，自組裝肽基材料有望構(gòu)建理想的藥物遞送系統(tǒng)，即使在流動(dòng)和沖洗的膀胱內(nèi)環(huán)境中，該系統(tǒng)也能在殘留腫瘤部位精確分布并延長(zhǎng)滯留時(shí)間。

受細(xì)菌衍生的FN結(jié)合肽和暴露的FN之間的分子識(shí)別，特異性細(xì)菌粘附到傷口的啟發(fā)，作者將這種肽引入自組裝肽系統(tǒng)，并開發(fā)了細(xì)菌啟發(fā)的可轉(zhuǎn)化納米粒子（BTN）。BTN肽由三個(gè)基序組成：（1）FN結(jié)合肽（GNRQRWFVVWLG）作為靶向基序，（2）氫鍵肽（KLVFF）作為自組裝基序，（3）十二烷基鏈作為疏水基序（方案1b）。最初，BTN肽可以自組裝成納米BTN，并包裹阿霉素（DOX）以獲得具有十二烷基和KLVFF基序疏水核心的DOX@BTN。DOX@BTN的工作原理如方案1c所示。（1）細(xì)菌引起的粘連：首先將DOX@BTN膀胱內(nèi)給藥，并在術(shù)后手術(shù)部位暴露FN。DOX@BTN在FN結(jié)合肽的引導(dǎo)下精確靶向暴露的FN，從而附著在殘留腫瘤上。（2）轉(zhuǎn)化和藥物濃縮：疏水核心限制KLVFF堆疊在一起并形成組織良好的分子間氫鍵。一旦與靶標(biāo)FN結(jié)合，BTN的配體與FN之間的結(jié)合力就打破了BTN疏水親水平衡的限制，啟動(dòng)了氫鍵肽之間的分子間氫鍵作用。因此，BTN從納米顆粒轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂?beta;-折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)的納米纖維（NFs），進(jìn)一步形成覆蓋殘留腫瘤的纖維涂層。NFs中的疏水域很容易通過(guò)疏水和π-π相互作用捕獲和儲(chǔ)存DOX，從而豐富手術(shù)部位中的化療藥物。DOX@BTN確保DOX的精確富集和延長(zhǎng)釋放，不受周期性排尿的影響，直接有效地殺死殘留的膀胱癌細(xì)胞并減少膀胱癌的復(fù)發(fā)（方案1c）。

根據(jù)固相多肽合成方法（圖S1），作者合成了FN可靶向和可轉(zhuǎn)化的C12-KLVFF-GNRQRW-FVVWLG型BTN多肽，以及兩個(gè)對(duì)照肽C1-BTN多肽（C12-KLVFF-GVRLWVQFRNWG）和C2-BTN多肽（C12-KAAGG-GNRQRWFVVWLG）。C1-BTN肽含有FN結(jié)合肽的自組裝基序，但不是靶向的擾亂序列。C2-BTN多肽具有FN靶向基序，但缺乏自組裝序列。因此，C1-BTN和C2-BTN都被設(shè)計(jì)成不能轉(zhuǎn)化為纖維結(jié)構(gòu)。采用快速沉淀法制備納米BTN和對(duì)照BTN（40μM，H₂O:DMSO = 99:1，v/v）。作者嘗試探索包括FN結(jié)合肽的BTN是否保留了特定的FN靶向能力。從黏附陣列（圖1A）可以發(fā)現(xiàn)BTN和C2-BTN對(duì)預(yù)包覆的FN層的結(jié)合能力分別是C1-BTN（擾亂靶向序列）的2.7和2.4倍，表明FN結(jié)合肽賦予納米FN靶向能力。BTN與FN的結(jié)合能力分別是牛血清白蛋白（BSA）、膠原和層粘連蛋白的4.3、3.0和3.6倍，表明BTN具有與FN的特異性結(jié)合能力。另外通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬預(yù)測(cè)了BTN在FN內(nèi)的結(jié)合域。FN的第13型結(jié)構(gòu)域（即FNIII13）在所選的FN結(jié)構(gòu)域（FN的7-10、11、12、13和14-16型結(jié)構(gòu)域）中范德華和庫(kù)侖相互作用能最大，表明BTN與FNIII13結(jié)合較強(qiáng)（圖S2）。然后，根據(jù)FN結(jié)合肽RWFV序列中結(jié)合能低、活性位點(diǎn)最多的位點(diǎn)，通過(guò)分子對(duì)接，篩選出較好的蛋白肽結(jié)合模型（即FNIII13-BTN肽）。目標(biāo)基序的VWLG序列與FN的T11，K19，I20，Y22，E23，E53，D55，A57之間發(fā)生了大的疏水相互作用（圖1b）。BTN肽和FN通過(guò)分子對(duì)接的代表性結(jié)合結(jié)構(gòu)，這種結(jié)合引發(fā)了BTN到納米纖維的轉(zhuǎn)化（圖1c）。

作者進(jìn)一步研究了BTN向NFs的轉(zhuǎn)化以及相應(yīng)的體外生物保留能力。將MCSs與Cy5標(biāo)記的BTN和C2-BTN共同孵育6h，分別于第0、1、2、3、4、5天觀察，每次觀察前更換MCSs的培養(yǎng)液。如圖2e和圖2f所示，在Cy5標(biāo)記的BTN和C2-BTN組中，在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)都檢測(cè)到比較熒光。C2-BTN組第二天熒光信號(hào)急劇衰減，第三天出現(xiàn)微弱的熒光信號(hào)，相比之下BTN處理的MCSs顯示出長(zhǎng)期的熒光信號(hào)。第5天BTN組的剩余熒光強(qiáng)度仍達(dá)到初始熒光強(qiáng)度的60.1%，幾乎是C2-BTN組的兩倍（圖2e，f）。這種長(zhǎng)時(shí)間的熒光可能是因?yàn)锽TN轉(zhuǎn)化成的NFs型，它牢固地附著在MCSs上，耐洗滌并長(zhǎng)期保留。為了驗(yàn)證BTN的牢固附著，使用掃描電子顯微鏡（SEM）直接觀察經(jīng)BTN處理1h后的MCSs表面。在MCSs上觀察到纏繞的纖維網(wǎng)絡(luò)，可能是來(lái)自BTN的交織的NFs，驗(yàn)證了牢固的附著。相比之下C2-BTN處理的MCS的表面呈現(xiàn)出相對(duì)光滑的外觀，表明C2-BTN在培養(yǎng)基更換期間被洗去（圖2g）。經(jīng)Cy5標(biāo)記BTN處理的L929 MCSs用ThT進(jìn)行染色，CLSM圖像不僅顯示ThT在480 nm處的綠色發(fā)射熒光增強(qiáng)，而且與Cy5的紅色熒光共域，Pearson相關(guān)系數(shù)（PCC）為0.77，提示MCSs中具有β折疊結(jié)構(gòu)的NFs（圖2h）。C2-BTN組的ThT熒光顯示較低的PCC（0.56），Cy5標(biāo)記的C2-BTN熒光呈紅色，表明C2-BTN的β折疊結(jié)構(gòu)較少。綜上所述，這些結(jié)果表明BTN可在細(xì)胞微環(huán)境中與FN牢固結(jié)合，并在MCSs上自組裝成具有β折疊結(jié)構(gòu)的相互交織的NFs，從而延長(zhǎng)滯留時(shí)間，可作為化療藥物的富集和緩釋庫(kù)。

作者使用小鼠原位膀胱模型（n=3）進(jìn)一步研究了BTN和C2-BTN在膀胱內(nèi)的滯留，該模型提供了具有動(dòng)態(tài)流體環(huán)境的人類膀胱的真實(shí)模擬。將Cy7標(biāo)記的BTN和C2-BTN注入酸蝕的膀胱。膀胱區(qū)的熒光信號(hào)以時(shí)間依賴的方式被監(jiān)測(cè)和量化（圖3e，f）。BTN治療組膀胱內(nèi)熒光信號(hào)從4 h開始減弱，但速度相對(duì)較慢，在膀胱內(nèi)排尿時(shí)表現(xiàn)出較好的抗排尿能力，而C2-BTN組在注射后12 h內(nèi)迅速下降。BTN組在72 h仍可觀察到清晰的BTN熒光信號(hào)，而C2-BTN組在42 h后未見明顯的熒光信號(hào)。每組的保留效率以起始熒光信號(hào)的百分比為指標(biāo)，72 h時(shí)BTN組為21.0±5.7%，是C2-BTN組（3.2±0.9%）的6.6倍（圖3e，f）。在心、肺、脾等系統(tǒng)器官中，幾乎沒有熒光信號(hào)，表明BTN膀胱內(nèi)灌注的生物安全性（圖S10）。最后，使用Bio-TEM和掃描電子顯微鏡分別驗(yàn)證了受損膀胱中的纖維涂層和交織纖維涂層（圖3g）。生物顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)BTN組大鼠膀胱內(nèi)壁表面有明顯的纖維結(jié)構(gòu)，而C2-BTN組大鼠膀胱內(nèi)壁表面無(wú)明顯纖維結(jié)構(gòu)（圖3h）。相應(yīng)的能量色散光譜（EDS）分析也鑒定了碘標(biāo)記的BTN多肽在纖維結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生的I特征信號(hào)（圖S11）。通過(guò)掃描電鏡觀察到BTN組擴(kuò)張性膀胱壁呈纖維狀包膜（圖3i），而在C2-BTN處理的膀胱內(nèi)腔表面無(wú)纖維結(jié)構(gòu)，可見少量顆粒狀碎片。在活鼠膀胱中，BTN能精確靶向手術(shù)床自組裝成NFs，牢固地附著在膀胱內(nèi)表面。這些結(jié)果為活體小鼠手術(shù)床中BTN的高積累和長(zhǎng)期滯留提供了直接證據(jù)，這對(duì)藥物的富集和持續(xù)釋放至關(guān)重要。

為了驗(yàn)證DOX@BTN具有靶向和長(zhǎng)期抗癌作用的*性，使用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析（RTCA）來(lái)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)DOX@BTN對(duì)細(xì)胞活力的影響，同時(shí)進(jìn)行常規(guī)CCK-8檢測(cè)（圖S15）。圖4b演示了實(shí)驗(yàn)方法。為提供豐富的靶細(xì)胞（FN）以便更好地轉(zhuǎn)化，在RTCA孔的底部預(yù)涂FN，然后接種膀胱癌細(xì)胞（MB49），*模擬了一個(gè)含有癌細(xì)胞殘留的體外傷口。DOX@BTN和游離DOX（臨床傳統(tǒng)治療方式作為對(duì)照）在MB49附著生長(zhǎng)后添加。1小時(shí)后用無(wú)DOX培養(yǎng)液更換上清液以模擬尿液沖洗，同時(shí)記錄細(xì)胞存活率（圖4b）。兩組細(xì)胞存活率在 4h內(nèi)先略有升高，之后逐漸下降。DOX@BTN組的下降速度明顯快于游離DOX組。在72 h時(shí)，DOX@BTN對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用明顯強(qiáng)于游離DOX（圖4c）。為證實(shí)在體外創(chuàng)傷模擬RTCA模型中是否形成了由納米纖維組成的纖維涂層，使用掃描電子顯微鏡觀察了預(yù)涂有FN的RTCA孔上的細(xì)胞（圖4d）。如圖4e所示，在DOX@BTN孵育1 h的細(xì)胞周圍觀察到成簇的纖維涂層，但游離DOX處理1 h后細(xì)胞仍保持黏附，沒有纖維涂層，由于沖刷，細(xì)胞背景清晰。培養(yǎng)上清與DOX或DOX@BTN孵育1 h后更換，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。掃描電鏡顯示DOX@BTN組細(xì)胞被纖維包膜覆蓋，細(xì)胞縮小碎裂，游離DOX組細(xì)胞與1 h時(shí)情況相似，背景清晰，無(wú)額外結(jié)構(gòu)（圖4e）。這些結(jié)果清楚地證明了在MB49細(xì)胞周圍形成由NFs組成的纖維涂層的證據(jù)，表明DOX@BTN通過(guò)與FN結(jié)合靶向并覆蓋MB49細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)DOX的長(zhǎng)期殺傷作用的持續(xù)釋放。

基于在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)交織纖維涂層的高蓄積和長(zhǎng)時(shí)間滯留，作者測(cè)試了纖維交織涂層對(duì)DOX的耐尿性和緩釋行為。酸蝕膀胱組灌胃阿霉素，同時(shí)灌胃游離阿霉素（0.5 mg/mL，相當(dāng)于920 μM）。收集尿液中釋放的DOX，在不同時(shí)間間隔內(nèi)進(jìn)行測(cè)量（圖4f）。尿液中的DOX濃度反映了膀胱內(nèi)的藥物含量。經(jīng)膀胱內(nèi)給藥可使DOX在膀胱內(nèi)定位，直接到達(dá)癌灶，發(fā)揮最大的治療效果。如圖4g所示，游離DOX組在16 h內(nèi)快速排泄，導(dǎo)致藥物快速消耗。DOX@BTN組藥物排泄緩慢，24 h后尤為明顯。DOX@BTN處理膀胱排出的DOX濃度顯著高于未處理膀胱排出的DOX濃度。DOX@BTN處理后膀胱72 h釋放的DOX濃度為11.8 μM，仍高于游離DOX的IC50值（1.4 μM），是游離DOX對(duì)照組的8.4倍（圖4g，圖S15）。將DOX@BTN和游離DOX分別與電灼傷小鼠的體外膀胱孵育。與游離DOX組相比，DOX@BTN組開放膀胱在靶區(qū)即手術(shù)床上顯示出較強(qiáng)的DOX熒光，證實(shí)了手術(shù)床內(nèi)藥物的精確濃縮。DOX@BTN組手術(shù)床上DOX的熒光強(qiáng)度（信號(hào)）與正常膀胱壁（噪聲）的比值是游離DOX組的2.2倍（圖S16）。結(jié)果證實(shí)DOX@BTN通過(guò)與暴露的FN結(jié)合，能夠特異性地靶向手術(shù)床，并有效地保留了DOX在體內(nèi)的長(zhǎng)期抗腫瘤作用。

受細(xì)菌對(duì)傷口黏附的啟發(fā)，作者成功開發(fā)了一種細(xì)菌誘導(dǎo)的可轉(zhuǎn)化納米顆粒（BTN），用于預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)。負(fù)載藥物的BTN能夠通過(guò)細(xì)菌衍生肽（FBP）與暴露的FN結(jié)合，精確地粘附在殘留腫瘤的手術(shù)部位。在靶向FN的引導(dǎo)下，DOX@BTN轉(zhuǎn)化為纖維涂層，具有長(zhǎng)期滯留作用，有助于DOX在殘留腫瘤中的持續(xù)釋放，達(dá)到精確殺傷的目的。作者建立了不*切除模型來(lái)模擬術(shù)后殘留腫瘤。在該模型中，DOX@BTN可明顯抑制腫瘤再生。在原位膀胱癌模型中，DOX@BTN組與傳統(tǒng)膀胱內(nèi)灌注（DOX）相比，復(fù)發(fā)率從71%降低到29%。大多數(shù)注射了DOX@BTN的小鼠至少存活了60天。這種BTN不僅為抑制膀胱癌的復(fù)發(fā)提供了一個(gè)全新的視角，而且也是*治愈膀胱癌的*佳臨床替代方案。在臨床實(shí)踐中，這種智能配方為管理其他實(shí)體腫瘤的復(fù)發(fā)提供了機(jī)會(huì)。